NgAgo或只能切割RNA，韩春雨论文不可重复性原因渐出水面
发布时间： 2017-01-23 18:15:23 点击量：
对于关心韩春雨NgAgo实验的人来说，2017年1月底是一个重要的时间节点，因为《自然-生物技术》（下称NBT）曾在去年11月28日发表声明称，将向论文作者提供机会，允许其在2017年1月底之前回应质疑、提供更多信息来支持自己的结论，届时，NBT会向公众公布论文作者的最新进展。然而，媒体误读了声明，以为NBT将在1月底之前公布调查结论。事实上，最近NBT只是收到了新的数据，并未给出任何明确意见，该期刊将继续开展可重复性调查。
但这并不妨碍NgAgo重新回到大众视野。1月20日，美国冷泉港实验室（CSHL）旗下的预印本网站BioRxiv发表了一篇来自韩国基础科学研究院基因组工程中心、科学技术联合大学院和韩国国立首尔大学化学系Jin-Soo Kim课题组的题为“DNA-dependent RNA cleavage by the Natronobacterium gregoryi Argonaute”的文章。该文指出NgAgo介导的是DNA依赖的RNA切割，但目前没有迹象能切割DNA。此前，韩春雨在NBT论文的卖点是对哺乳动物细胞基因组进行编辑，而基因编辑的前提条件是对DNA的切割，韩春雨等也在其图1和图3分别展示了NgAgo在体外和体内切割DNA的结果。显然，韩国研究组也无法重复其对DNA的体外切割实验。如果韩国课题组该结果被业界广泛重复和验证，则将从根本上否定韩春雨论文报道的用NgAgo作为DNA编辑工具的可能性。
值得一提的是，韩国课题组此番发表的这个DNA依赖性的RNA剪切并非新发现，比如早在十几年前，美国洛克菲勒大学的Tomas Tushcl实验室与Dinshaw J. Patel实验室就已经对此有所报道。
——《赛先生》
下文来自微信公众号“BioArt”，经授权转载。
1月20日，美国冷泉港实验室（CSHL）旗下的预印本网站BioRxiv发表了一篇来自韩国基础科学研究院基因组工程中心、科学技术联合大学院和韩国国立首尔大学化学系Jin-Soo Kim课题组的题为“DNA-dependent RNA cleavage by the Natronobacterium gregoryi Argonaute”的文章，该文指出NgAgo介导的DNA依赖的RNA切割是有效的。
值得注意的是，该文的通讯作者Jin-Soo Kim正是2016年11月28日领衔在Nature Biotechnology杂志发表题为“Failure to detect DNA-guided genome editing using Natronobacterium gregoryi Argonaute”的correspondence类型的文章，直指 NgAgo 不能够进行基因编辑。Jin-Soo Kim一直是基因编辑领域的大腕，在NBT和其他一流杂志上曾发表过多篇关于基因编辑的重要文章。
Jin-Soo Kim课题组在预印本网站BioRxiv发表的文章在摘要中清晰地指出，NgAgo能够作为一种DNA引导的核酸内切酶靶向性切割RNA而不是DNA（下图）。作者证实了NgAgo能在体外与5’ 羟基化或者磷酸化的单链DNA组合，将RNA切割成两个或多个片段。
NgAgo在gODN的作用下能够特异性的切割对应基因的RNA转录本，显然并不作用于单链DNA（ssDNA）或者双链DNA（dsDNA）（下图）。
上述结果很好地解释了为什么此前许多实验室都能够做出韩春雨去年5月2号发表在NBT中的Figure 3图，既降低外源GFP的表达。这也解释了去年11月11日Cell Research以Letter to Editor形式在线发表的来自南通大学和复旦大学研究人员合作完成的题为“NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish”的论文中发现 gDNA/NgAgo 系统在斑马鱼中能实现特定基因敲低导致鱼眼部发育缺陷，但是不能对靶基因进行基因编辑。此外，更早以前北大魏文胜实验室运用 gDNA/NgAgo 系统也能看到目的基因的表达下调但不能实现DNA编辑。韩国科学家的这项研究可能为gDNA/NgAgo 系统的基因编辑引发的系列争议给出了比较好的解释和实验证据，看来gDNA/NgAgo 系统确实能在体外很好的实现RNA的编辑（下图）。
关于在8月8日，韩春雨向质粒共享信息库 Addgene 提交新版的详细实验方法，其中特别提到了转染中应避免EDTA对镁离子的鳌合问题（Because Agos need magnesium, avoid EDTA when detaching and seeding cells into the plates for transfection，引自韩春雨向Addgene提交的新版实验方法）。在预印本的这篇文章中专门设计了实验证明在体外实验中，在有EDTA的情况下，NgAgo确实不能切割RNA（下图）。
比较好玩的一点是，NgAgo 能重复使用，反复切割。相比之下一个 Cas9 分子只能使用一次（下图）。
作者在文章最后的讨论部分提到，NgAgo系统可以用来作为生物医学研究的一种RNAi工具来介导特异性的mRNA或者lncRNAs的降解。
要点：该课题组可能为了抢速度，直接把论文公布在预印本网站上而不是走同行评议渠道发表在正式的期刊上，关键一点是上述实验都是在体外进行的，所以后续还需要进一步在体内进行验证。鉴于课题面临的竞争，想必还有其他课题组也在完成类似的工作。让我们拭目以待吧！
