癌症精准治疗时代下循环游离DNA的应用：分析前和分析后的相关问题（一）
发布时间： 2017-02-22 17:31:40 点击量：
cfDNA试验的主要作用是获取关于肿瘤细胞遗传改变的信息，但分析患者的cfDNA时，目的是分析来自肿瘤细胞的DNA片段，也就是循环肿瘤DNA (ctDNA)。不幸的是，ctDNA在癌症患者总cfDNA中所占比例很小，从0（检测不到）-11.7%。血液中肿瘤和非肿瘤DNA混合在一起给cfDNA的临床分析带来一些问题。因为需要从大比例的正常细胞DNA中将基因畸变辨别出来，因此也要求cfDNA分析方法具有高度的敏感性和特异性。但是，现在没有可以将cfDNA库中的ctDNA比例进行定量的方便、经济的方法，这限制了cfDNA试验的临床应用。
早期关于ctDNA比例定量的尝试工作倚靠肿瘤特异性基因畸变的识别。最成功的例子是Diehl等的研究。通过扩展结直肠癌切除标本中一个包含APC, TP53, PIK3CA和KRAS的面板，他们获得了纳入患者基线体细胞突变谱。在随访中，使用基于数字PCR的BEAMing技术对这些患者进行了突变分析。他们将ctDNA定义为在相应肿瘤组织中包含至少一种突变的DNA，他们成功计算出了每个样本中ctDNA的比例和拷贝数。但是，当选择用于ctDNA识别的分子指纹时应特别谨慎，因为实体瘤的生长模型是不断进化的。从理论上来说，建立者突变(founder mutations)或那些发生在原发肿瘤中建立者细胞（founder cell）中的突变应该优先考虑，虽然他们可能不具有选择性优势，因为这些畸变可能在肿瘤微进化的整个过程中都存在，在血液中可持续检测到。
虽然有大量证据表明了这个方法的潜力，但它仍然存在一些局限性。首先是需要对原发肿瘤的基因谱和表达谱全面掌握，而这在不可手术的肿瘤中是无法获得的。因为瘤内异质性的存在，活检通常会带来信息偏倚，所以活检不应用于绘制癌症患者的基线突变谱。另一个重要的问题是可作为ctDNA标记物的基因畸变可能很难发现。由于大规模平行测序技术的进步，现在可同时筛查130多个候选基因的500多个区域，以绘制某个人的基线突变谱，从而改进ctDNA的识别。除了基因畸变，一些表观遗传特征，如甲基化，也可以用于将ctDNA从的cfDNA中区分出来。
一些研究者通过另一种方法从cfNDA中识别ctDNA。简言之，cfDNA的径谱峰值是∼166 bp，与染色体的长度相似，表示大部分cfDNA是通过细胞凋亡产生的。一项在体研究显示异种移植大鼠的平均cfDNA长度下降到∼130 bp。利用这一特征有可能将ctDNA从基因组DNA中区分出来。
基因表达谱也可以作为癌症的标识符。但是，循环RNA的不稳定性限制了其应用。研究者发现不同组织和细胞中的核小体定相不同，可能可用于区分cfDNA的组织来源。基于片段大小或核小体间隔和定位将ctDNA从基因组DNA中区分出来看上去是很有前景的方法，但是将其转化为可用于日常cfDNA分析中方法仍然需要数年的研究。
最近出现的DNA直接成像技术可以使双螺旋结构可视化，并获取定量参数。鉴于肿瘤细胞中组蛋白和DNA双螺旋结构空间关系的改变，直接成像用于识别肿瘤来源的DNA似乎很有希望。但是，与其他新技术一样，将其转化为临床上有效可行的方法也有很长的路要走。
