癌症精准治疗时代下循环游离DNA的应用：分析前和分析后的相关问题（二）
发布时间： 2017-02-22 17:42:57 点击量：
分析前相关问题
一般情况下，癌症患者血浆cfDNA的浓度比健康人群要高。但是，其浓度在不同患者组间变化很大（健康人群和癌症患者1ml的血浆分别包含0.3-10.3 ng及8-798 ng的cfDNA）。这在一定程度上反映了不同癌症类型之间的不同性质；但是，血液提取过程本身也会影响测量浓度。一项最新研究显示血液提取时间（7:00, 12:00, 17:00)可能会造成cfDNA产量不同，虽然未发现统计学差异。现在没有关于从不同部位提取血液是否会影响cfDNA质量或数量的数据，我们对于坏死和凋亡的DNA是如何在活体内降解的知之甚少。因此，很难说从原发肿瘤的近端引流静脉取血样是否能够在某种程度上降低降解的程度。
关于采血管中所用的抗凝剂，乙二胺四乙酸（EDTA）优于肝素，因为后者不会阻止核酸内切酶的活动。其他选择包括Streck采血管(Streck, Omaha,NE, USA)和CellSave储存管(Janssen Diagnostics, Raritan, NJ, USA)。近期一项研究比较了这些采集管的DNA保存能力，结果显示在短暂的时间窗内三个采集管的cfDNA稳定性相当（采血和cfDNA提取之间不超过6小时），但是在更长的时间内较昂贵的Streck采血管的cfDNA储存能力更好（他们的研究中是~48小时，厂商声明为14天）。但是，研究也显示当在4°C的条件下储存时，K2EDTA采血管和Streck采血管的表现一样好。
Bronkhorst等的综述总结道，分析前的每一个步骤，从抽血到DNA提取，都会影响cfDNA的最终产量。影响因素包括离心、存储温度、解冻温度和所用提取试剂。
从技术角度来看，现在的cfDNA提取技术可分为三类：相分离、硅胶模离心柱以及磁珠分离法。在2015年末开展的SPIDIA外部质量控制项目中，当对其他分析前变量进行控制之后，结果显示沉淀法的DNA完整性指数要比离心柱法高。这些结果与两项早期研究的结果一致，其中一项包括改良的氯仿-酚分离以及异丙醇沉淀法。对于处理成批样本的实验室，可以考虑自动化平台。值得注意的一件事是离心柱和磁珠上结合的DNA片段长度具有偏性。例如，QIAamp bloodmini kit试剂盒(Cat. No:51104; Qiagen, Hilden, Germany)主要富集>200 bp的DNA片段，因此用于提取cfDNA时，它要次于QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit试剂盒(Cat. No: 55114; Qiagen, Hilden, Germany)，因为cfDNA的长度主要集中在166-200 bp。
另一件值得注意的事情是许多研究者采取了基于定量PCR（qPCR）的方法来评估cfDNA的质量和数量。但是，当用于评估一个提取方法的有效性时这些方法存在引入偏倚的风险，因为qPCR引物优先扩增更长、更完整的DNA序列。因此，qPCR容易高估为提取较长的DNA片段而设计的试剂盒的实际提取效率。将分析cfDNA产量和完整性的两种方法—qPCR和毛细管电泳进行比较，结果显示后者具有更高的可重复性。新一代测序技术NGS使得从几滴血浆中检测DNA信息成为可能，将来人们可能在家就能绘制自己的基因谱。研究者也在努力优化cfDNA分析前程序，以减少DNA损失和提高cfDNA产量，其他生物材料上取得的进步也可能改进cfDNA提取。
然而，最具创新性的血浆处理方法是无需提取DNA而直接进行检测。Umetani等首次发表了关于直接PCR测序而无需DNA提取的临床应用数据。Breitbach等的研究不仅提供了无需从血浆中提取DNA而直接进行PCR测序的可行性证据，也显示未纯化血浆中的cfDNA浓度分别是QIAamp blood mini kit洗脱液和苯酚-氯仿-异戊醇提取物的2.79和1.14倍。遗憾的是，作者未介绍从未纯化血浆中得到的DNA分子的片段分布。对于一般的下游分析，如实时PCR和NGS，相分离、离心柱以及磁珠提取法仍然是一线选择，因为他们可以用于浓缩血浆中的cfDNA，从而满足输入DNA浓度的要求。但是，将来随着高度敏感的数字化PCR试验的实施，省时、无偏倚的非提取方案可能会受到欢迎。
